Synthesis of neo-glycoproteins for binding studies and scavenging of Clostridium difficile toxin A - of microgels and biosensors

• Synthese von Neo-Glykoproteinen für Bindungsstudien und das Abfangen von Clostridium difficile Toxin A - von Mikrogelen und Biosensoren

Heine, Viktoria; Elling, Lothar (Thesis advisor); Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Infektionen durch Clostridium difficile verursachen enorme Kosten im Gesundheitswesen. Das Bakterium besiedelt den menschlichen Darmtrakt und sondert Toxine ab, die die Epithelzellschicht des Dickdarms zerstören. Die Toxine binden an Zelloberflächenglykane auf menschlichen Darmzellen und lösen Prozesse aus, die schließlich zum Zelltod führen. Da Toxin A eine Kohlenhydrat-Erkennungsdomäne mit kombinierten repetitiven Oligopeptid-Domänen umfasst, kann es mehrere Glykan-Liganden auf einmal binden. Diese Eigenschaft kann zur Erhöhung der Wechselwirkungsstärke zwischen Ligand und Toxin durch Multivalenz ausgenutzt werden und lässt sich auf andere Toxine mit Kohlenhydrat-Erkennungsdomänen übertragen. Um den bestmöglichen Liganden für C. difficile Toxin A zu finden, wurde eine Ligandenbibliothek (in Microtiterplatten) erstellt. Multivalente Neo-Glykoproteine dienten als Gerüst für komplexe Glykosylierungsmuster, um eine Bibliothek von 40 Glykanstrukturen zusammenzustellen. Das Screening dieser Bibliothek mit der Rezeptordomäne von Toxin A präsentierte Lewisy-Lewisx-BSA als vielversprechenden Toxin-Scavenger. Tests mit dem Holotoxin bestätigten die Ergebnisse und der Ligand wurde für in vitro Anwendungen hergestellt. Für die Synthese des Glykans (Lewisy-Lewisx) wurde ein Satz effizienter Fucosyltransferasen etabliert und mit einer Reihe neuer Substrate (N-Acetyllactosamin-Tetrasaccharide) getestet, wobei unerwartete Fucosylierungsmuster entdeckt wurden. Der Toxin-A-Ligand wurde hergestellt und an BSA gekoppelt. Die so produzierten Neo-Glycoproteine wurden für die Kopplung an Mikrogele weiterverwendet. Neo-Glykoproteine und Neo-Glykoprotein-präsentierende Mikrogele waren in der Lage, menschliche Zellen vor Toxin A zu schützen. Außerdem zeigten die Neo-Glykoproteine eine gute Affinität zum Cholera-Toxin. Daher kann Lewisy-Lewisx-BSA als ein Zwei-in-Eins-Ligand angesehen werden. Um ein tieferes Verständnis des Bindungsverhaltens zu ermöglichen, wurde ein Neo-Glykoprotein-Biosensor etabliert. BSA-Neo-Glykoproteine, die N-Acetyllactosamin tragen, wurden an den Biosensor gebunden und auf dem Chip glykosyliert. Online-Messungen ermöglichten erstmals die Echtzeit-Untersuchung der kinetischen Bindungsprozesse zwischen Glykan und Enzym bzw. Glykan und Lektin mittels elektrochemischer Impedanzspektroskopie. Dieser Ansatz könnte auf eine Vielzahl von Interaktionspartnern übertragen werden. Zusammenfassend ebnet diese Arbeit den Weg zur Behandlung bakteriell assoziierter Erkrankungen durch die Etablierung von Toxin-Scavengern und die Entwicklung neuartiger Analysemethoden für Toxin-Ligand-Wechselwirkungen.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehr- und Forschungsgebiet Biomaterialien [162820]