DNA methylation changes in hematopoietic development and iPSC-derived model systems

  • DNA Methylierungs-Veränderungen in der hämatopoetischen Entwicklung und in aus iPS-Zellen abgeleiteten Modellsystemen

Frobel, Joana; Wagner, Wolfgang (Thesis advisor); Elling, Lothar (Thesis advisor); Zenke, Martin (Thesis advisor)

Aachen (2018)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2018

Kurzfassung

Humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) stellen eine attraktive Zellquelle für die in vitro Herstellung verschiedener Zelltypen dar und könnten somit in der regenerativen und personalisierten Medizin Anwendung finden. Die de novo DNA Methylierung (DNAm) ist ein epigenetischer Mechanismus, der in solchen Differenzierungsprozessen eine wichtige Rolle spielt. Er wird durch die DNA Methyltransferase 3A (DNMT3A) reguliert, welche gewebe- und krankheitsspezifisch gespleißt wird. DNMT3A spielt insbesondere für die Differenzierung von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) sowie für die Entstehung hämatologischer Erkrankungen eine wichtige Rolle. Bisher ist weitestgehend unbekannt, ob zelltypspezifische DNAm Muster in Zellen, die aus iPSCs abgeleitet wurden, rekapituliert werden und inwiefern die Regulation von DNMT3A Transkripten einen Einfluss auf die hämatopoetische Differenzierung hat. In der vorliegenden Arbeit wurden DNAm Veränderungen während der Differenzierung von iPSCs in mesenchymale Stromazellen (MSCs) untersucht und wesentliche Unterschiede zwischen den aus iPSCs abgeleiteten MSCs (iPS-MSCs) und ursprünglichen MSCs festgestellt. Um die Relevanz verschiedener DNMT3A Spleißvarianten zu untersuchen, wurden einzelne Transkripte mittels shRNAs in HSPCs herunterreguliert. Insbesondere die Herunterregulation der Transkripte 2 und 4 führte zu einer signifikant verringerten Proliferation der HSPCs. Transkript 2 scheint zusätzlich eine wesentliche Rolle für die verringerte Expression von CD34 während der Kulturexpansion von HSPCs zu spielen, wohingegen die Herunterregulation von Transkript 4 zu einer vornehmlichen Differenzierung in erythropoetische koloniebildenden Einheiten in CFU Assays führte. Die Analyse genomweiter Genexpressions- und DNAm-Profile zeigte, dass einzelne DNMT3A Transkripte unterschiedliche Genomregionen modifizieren. Zusätzlich scheint die Entfernung eines kodierenden Exons der DNA Methyltransferase-Domäne mittels CRISPR/Cas9 einen möglichen Einfluss auf das Differenzierungspotential von aus iPSCs abgeleiteten HSPCs (iPS-HSPCs) in einem CFU Assay zu haben. Im Gegensatz dazu war die spontane Differenzierung der iPSCs und deren direkte Differenzierung in iPS-HSPCs nicht beeinflusst. Weiterhin wurden die Effekte einer xenogenen Umgebung auf das epigenetische Muster in humanen HSPCs in einem murinen Transplantationsmodell untersucht. Genomweite Analysen von DNAm Profilen zeigten, dass die stabil integrierten hämatopoetischen Zellen charakteristische DNAm Muster der B Zell Richtung aufweisen, was Ergebnissen der immunphänotypischen Charakterisierung entspricht. Die murine Umgebung ermöglicht folglich epigenetische Veränderungen, welche während der humanen hämatopoetischen Entwicklung beobachtet werden, wohingegen die schneller alternde Umgebung keinen Einfluss auf das epigenetische Alter der transplantierten Zellen zu haben scheint. Anschließend wurde untersucht, ob zelltypspezifische DNAm Muster für die Bestimmung der Zellzusammensetzung des Blutes eine potenzielle Anwendung in der Klinik finden können. Es wurden einzelne CG Dinukleotide identifiziert, deren Methylierungsstatus eine Bestimmung der zellulären Zusammensetzung des Blutes erlauben. Dieser sogenannte Epi-Blood-Count stellt eine robuste Methode für die Bestimmung von Zellzahlen in gefrorenem und gelagertem Blut anhand von zelltypspezifischer DNAm dar. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstreichen die Relevanz einer präzisen Regulation der DNAm während der zellulären Differenzierung, welche durch DNMT3A Varianten moduliert werden kann. Weiterhin wird eine Perspektive zur Anwendung solcher epigenetischen Charakteristika in der Diagnostik zur Verfügung gestellt.

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