Design and characterization of galectin-3 fusion proteins and novel multivalent galectin-3 ligands

Aachen (2018) [Doktorarbeit]

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Kurzfassung

Galectin-3 (Gal-3) spielt eine Schlüsselrolle in vielen biologischen Prozessen, wie der Tumorprogression und Immunantwort. Dies wird durch spezifische Bindung und Vernetzung von Galaktose-basierenden Glykanen moduliert. In Tumorregionen kann Gal-3, das aus einer N-terminalen Domäne und einer Glykan-Erkennungsdomäne besteht, N-terminal durch Metalloproteinasen gespaltet werden. Die Trunkierung von Gal-3 spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von Affinität und Selbstassoziation.Ziel dieser Arbeit war die detaillierte Analyse von Gal-3 aus zwei Blickwinkeln: Erstens wurde die Bindung von Gal-3 nach Modifikation des Proteins analysiert. Zwölf Gal-3-Konstrukte mit N-terminaler Trunkierung (Δ1-62 und Δ1-116) und Fusionen mit SNAP-Tag und/oder gelb fluoreszierendem Protein (YFP) wurden designt und rekombinant hergestellt. Anschließend wurde der Einfluss der Trunkierung und der Fusionspartner auf die Gal-3-Bindung untersucht. Veränderte Bindung zu Asialofetuin (ASF) wurde in ELISA und Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) Bindungsassays beobachtet. Die höchste Affinität wurde für Gal-3(Δ1-62) bzw. natives Gal-3 nachgewiesen, während Gal-3(Δ1-116) nur schwach bindet. Zum ersten Mal wird gezeigt, dass SNAP-Tag und YFP-Fusionen von Gal-3 und trunkiertem Gal-3 die Bindungsaffinität zu ASF modulieren und verbessern. Fusionen von trunkiertem Gal-3 mit YFP stellten die Bindungseigenschaften ähnlich zu nativem Gal-3 wieder her. In Kombination mit einem SNAP-Tag wurden sogar verbesserte Bindungseigenschaften erhalten. Die Ergebnisse zeigen, dass die N-terminale Domäne für die Ligandenbindung wichtig ist. Das Selbstassoziationspotential von Gal-3 schien von den Modifikationen nicht beeinflusst zu sein, was auf die Wechselwirkung von Gal-3 über den C-Terminus hindeutet. Zweitens wurde die Gal-3-Bindung aus Ligandensicht analysiert. Da Gal-3 in vielen Krebszellen hochreguliert wird, ist es ein potenzielles Target für die Tumortherapie und -diagnostik. Auf der Suche nach hochaffinen Gal-3-Liganden wurde eine Methode zur effizienten Synthese von multivalenten Neo-Glykoproteinen etabliert. Durch Konjugation von N-Acetyllactosamin (LacNAc) basierten Tetrasacchariden an Albumin mit Hilfe des homobifunktionellen Linkers Squaratsäurediethylester erhielten wir Glykan-Protein-Konjugate mit einstellbarer Multivalenz mit bis zu 29 Bindungsstellen. Zum ersten Mal wurde der Einfluss der definierten Glykandichte von Neo-Glykoproteinen auf die Gal-3-Bindung untersucht. Die Affinität nahm mit zunehmender Glykosylierungsdichte zu und multivalente Effekte traten bei Gal-3 Konzentrationen, wie sie im Serum vorkommen, auf. Des Weiteren synthetisierten wir neuartige biotin-modifizierte Glykane und wiesen eine hohe Affinität und Selektivität für Gal-3 gegenüber Galectin-1 nach. Nach deren Konjugation an Albumin erreichten biotinylierte Neo-Glykoproteine hohe Gal-3-Bindungsniveaus bei geringerer Glykosylierungsdichte als Nicht-biotinylierte. Die effiziente und selektive Bindung unserer maßgeschneiderten Neo-Glykoproteine macht sie zu geeigneten Kandidaten für das Targeting von Gal-3 in der biomedizinischen Forschung. Die beiden Aspekte dieser Arbeit ebnen den Weg für zukünftige Anwendungen in der Tumortherapie und -diagnostik. Es wurden wichtige Erkenntnisse über die Bindungseigenschaften von trunkiertem Gal-3 geliefert und darüber hinaus, wie Galektine durch Fusionen maßgeschneidert und auf eine höhere Bindungsstärke gebracht werden können. Die Ergebnisse erweitern zudem die neusten Ansätze zum Design hochaffiner Liganden.

Autorinnen und Autoren

Autorinnen und Autoren

Böcker, Sophia

Gutachterinnen und Gutachter

Elling, Lothar
Jahnen-Dechent, Wilhelm

Identifikationsnummern

  • REPORT NUMBER: RWTH-2018-223859

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