Design and characterization of galectin-3 fusion proteins and novel multivalent galectin-3 ligands

  • Design und Charakterisierung von Galektin-3 Fusionsproteinen und Neuartigen Multivalenten Galektin-3 Liganden

Böcker, Sophia; Elling, Lothar (Thesis advisor); Jahnen-Dechent, Wilhelm (Thesis advisor)

Aachen (2018)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2018

Kurzfassung

Galectin-3 (Gal-3) spielt eine Schlüsselrolle in vielen biologischen Prozessen, wie der Tumorprogression und Immunantwort. Dies wird durch spezifische Bindung und Vernetzung von Galaktose-basierenden Glykanen moduliert. In Tumorregionen kann Gal-3, das aus einer N-terminalen Domäne und einer Glykan-Erkennungsdomäne besteht, N-terminal durch Metalloproteinasen gespaltet werden. Die Trunkierung von Gal-3 spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von Affinität und Selbstassoziation.Ziel dieser Arbeit war die detaillierte Analyse von Gal-3 aus zwei Blickwinkeln: Erstens wurde die Bindung von Gal-3 nach Modifikation des Proteins analysiert. Zwölf Gal-3-Konstrukte mit N-terminaler Trunkierung (Δ1-62 und Δ1-116) und Fusionen mit SNAP-Tag und/oder gelb fluoreszierendem Protein (YFP) wurden designt und rekombinant hergestellt. Anschließend wurde der Einfluss der Trunkierung und der Fusionspartner auf die Gal-3-Bindung untersucht. Veränderte Bindung zu Asialofetuin (ASF) wurde in ELISA und Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) Bindungsassays beobachtet. Die höchste Affinität wurde für Gal-3(Δ1-62) bzw. natives Gal-3 nachgewiesen, während Gal-3(Δ1-116) nur schwach bindet. Zum ersten Mal wird gezeigt, dass SNAP-Tag und YFP-Fusionen von Gal-3 und trunkiertem Gal-3 die Bindungsaffinität zu ASF modulieren und verbessern. Fusionen von trunkiertem Gal-3 mit YFP stellten die Bindungseigenschaften ähnlich zu nativem Gal-3 wieder her. In Kombination mit einem SNAP-Tag wurden sogar verbesserte Bindungseigenschaften erhalten. Die Ergebnisse zeigen, dass die N-terminale Domäne für die Ligandenbindung wichtig ist. Das Selbstassoziationspotential von Gal-3 schien von den Modifikationen nicht beeinflusst zu sein, was auf die Wechselwirkung von Gal-3 über den C-Terminus hindeutet. Zweitens wurde die Gal-3-Bindung aus Ligandensicht analysiert. Da Gal-3 in vielen Krebszellen hochreguliert wird, ist es ein potenzielles Target für die Tumortherapie und -diagnostik. Auf der Suche nach hochaffinen Gal-3-Liganden wurde eine Methode zur effizienten Synthese von multivalenten Neo-Glykoproteinen etabliert. Durch Konjugation von N-Acetyllactosamin (LacNAc) basierten Tetrasacchariden an Albumin mit Hilfe des homobifunktionellen Linkers Squaratsäurediethylester erhielten wir Glykan-Protein-Konjugate mit einstellbarer Multivalenz mit bis zu 29 Bindungsstellen. Zum ersten Mal wurde der Einfluss der definierten Glykandichte von Neo-Glykoproteinen auf die Gal-3-Bindung untersucht. Die Affinität nahm mit zunehmender Glykosylierungsdichte zu und multivalente Effekte traten bei Gal-3 Konzentrationen, wie sie im Serum vorkommen, auf. Des Weiteren synthetisierten wir neuartige biotin-modifizierte Glykane und wiesen eine hohe Affinität und Selektivität für Gal-3 gegenüber Galectin-1 nach. Nach deren Konjugation an Albumin erreichten biotinylierte Neo-Glykoproteine hohe Gal-3-Bindungsniveaus bei geringerer Glykosylierungsdichte als Nicht-biotinylierte. Die effiziente und selektive Bindung unserer maßgeschneiderten Neo-Glykoproteine macht sie zu geeigneten Kandidaten für das Targeting von Gal-3 in der biomedizinischen Forschung. Die beiden Aspekte dieser Arbeit ebnen den Weg für zukünftige Anwendungen in der Tumortherapie und -diagnostik. Es wurden wichtige Erkenntnisse über die Bindungseigenschaften von trunkiertem Gal-3 geliefert und darüber hinaus, wie Galektine durch Fusionen maßgeschneidert und auf eine höhere Bindungsstärke gebracht werden können. Die Ergebnisse erweitern zudem die neusten Ansätze zum Design hochaffiner Liganden.

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