In vitro Expansion humaner mesenchymaler Stammzellen in 2D und 3D Kultursystemen und Analyse genetischer und epigenetischer Folgen der Langzeitkultivierung

Aachen (2016, 2017) [Doktorarbeit]

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Kurzfassung

Mesenchymale Stammzellen stellen aufgrund ihres Differenzierungspotentials und ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften eine attraktive Quelle für den Einsatz in der regenerativen Medizin dar. Da für die meisten klinischen Anwendungen hohe Zellzahlen benötigt werden, ist eine in vitro Expansion der Zellen vor der Transplantation notwendig. Jedoch ist die Lebensspanne von MSCs in vitro limitiert – nach einer bestimmten Anzahl an Zellteilungen erreichen sie die replikative Seneszenz, die durch morphologische und funktionelle Veränderungen der Zellen gekennzeichnet ist. In der vorliegenden Arbeit zeigte eine Analyse der Subpopulationen im Verlauf der Langzeitkultivierung, dass die Zahl an CFU-fs und klonalen Subpopulationen mit hohem Differenzierungspotential bereits in frühen Passagen abnimmt. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass das Monitoring der CFU-f Frequenz über die nachfolgenden Passagen als Indikator für die verbleibenden Populationsverdopplungen bis zum Erreichen der Seneszenz verwendet werden kann. Darüber hinaus sollte die genetische und epigenetische Stabilität von MSCs im Verlauf der Langzeitkultur als Faktor für den klinischen Einsatz der Zellpräparationen in Betracht gezogen werden. Die Analyse genetischer Folgen der Zellexpansion mittels Karyotyping und SNP-Array ergab keine relevanten chromosomalen Abberationen. Allerdings zeigten DNA-Methylierunsprofile im Verlauf der Langzeitkultur hoch-konsistente seneszenz-assoziierte Modifikationen an spezifischen CpGs-Sites. Die DNA-Methylierungsveränderungen korrelierten mit repressiven Histonmodifikationen wie H3K9me3, H3K27me3 und EZH2-Targets aus vorherigen Studien. Des Weiteren wurden die Folgen der MSC-Expansion auf elastischen PDMS-Substraten untersucht. Es konnte bestätigt werden, dass das adipogene und osteogene Differenzierungspotential jeweils auf weichen bzw. festen Substraten verstärkt wird. Dieser Effekt ging jedoch verloren sobald die Zellen von PDMS-Substraten auf TCP umgesetzt wurden. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen zeigten globale Genexpressions- und DNA-Methylierungsprofile von MSCs kultivert auf verschieden Elastizitäten nur geringfügige Unterschiede. Anschließend wurde der Einfluss der Oberflächentopographie von PVDF-Fasern und der Porengrößen in 3D-PVDF-Vliesen auf das MSC-Zellverhalten untersucht. Die Zellen richteten sich in den Scaffolds entlang der Fasern aus und bildeten Poren-überspannende Zellteppiche aus. MSCs in PVDF-Vliesen mit runder Faserform und kleinen Poren wiesen die höchsten Proliferationsraten auf. Außerdem konnte gezeigt werden, dass PVDF-Vliese eine Langzeitkultivierung von MSCs über mindestens 15 Tage und eine effiziente adipogene Differenzierung erlauben. Zusammengefasst geben die Ergebnisse dieser Arbeit weiteren Einblick in die Folgen der in vitro Expansion von MSCs auf Zellkulturplastik bzw. verschiedenen Biomaterialien.

Autorinnen und Autoren

Autorinnen und Autoren

Schellenberg, Anne

Gutachterinnen und Gutachter

Wagner, Wolfgang
Zenke, Martin
Elling, Lothar

Identifikationsnummern

  • REPORT NUMBER: RWTH-2017-00930