Entwicklung eines Enzym-Modul-Systems zur Synthese und in situ Regeneration von dTDP-aktivierten Desoxyzuckern

  • Development of an Enzyme Module System for the synthesis and in situ regeneration of dTDP-activated deoxysugars

Rupprath, Carsten; Elling, Lothar (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2007)
Doktorarbeit

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2007

Kurzfassung

In dieser Arbeit war es erstmalig möglich, glykosylierte Naturstoffe in vitro durch in situ Regeneration von dTDP-aktivierten Desoxyzuckern herzustellen. Die von EU-Projektpartnern erhaltenen Desoxyzuckerbiosynthesegene aus dem Avilamycin- (AviS, AviT), Urdamycin- (UrdR) und Midekamycin-Biosynthesecluster (MidC, MidH und MidK) für die enzymatische Synthese NDP-aktivierter Desoxyzucker erwiesen sich bei der Expression in E. coli bzw. S. lividans (MidK) als schwerlöslich (inclusion bodies). Nach einer umfangreichen Expressionsoptimierung konnten alle Gene löslich exprimiert und im 10-20-L-Maßstab fermentiert und aufgereinigt werden. Allerdings zeigten weder die Enzympaare AviS/AviT/UrdR noch MidC/MidH/MidK eine Aktivität. Für die Synthesen von dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose und von dTDP-L-Rhamnose wurden die Enzyme dTMP-Kinase, SuSy, RmlB, RmlC-His und RmlD-His im 10-20-L-Maßstab fermentiert und präparativ aufgereinigt. Die Aufreinigung von RmlC- und RmlD-His wurde durch Fusion mit einem His-Tag deutlich erleichtert, da ein einziger IMAC-Schritt für die Produktion von hochreinem Enzym ausreichte. Die präparative Synthese der dTDP-L-Rhamnose, ausgehend von den preiswerten Substraten dTMP und Saccharose, wurde mit den hochaufgereinigten Enzymen RmlC und RmlD deutlich beschleunigt und es konnte sehr ökonomisch die bisher größte Menge an dTDP-L-Rhamnose produziert werden (~200 mg). Die Glykosyltransferase SorF aus dem Sorangicin Biosynthesecluster von Sorangium cellulosum So ce 12 katalysiert den Transfer von NDP-aktivierten Zuckern auf das Aglykon Sorangicin A. Nach einer 10-L-Fermentation und affinitätschromatographischer Aufreinigung des Enzyms wurde ein Aktivitätstest entwickelt und das pH- sowie Temperaturoptimum von SorF bestimmt. Mit einer Gelfiltration konnte das native Molekulargewicht bestimmt werden und es wurde festgestellt, dass das Enzym als Monomer vorliegt. Die Bestimmung des Substratspektrums von SorF ergab eine außergewöhnliche Substratpromiskuität. Nicht nur das natürliche Produkt Glucosyl-Sorangiosid, sondern auch die neuartig glykosylierten Sorangioside 6-Desoxy-4-keto-glucosyl-Sorangiosid, Galactosyl-Sorangiosid, Xylosyl-Sorangiosid und Rhamnosyl-Sorangiosid wurden erstmalig produziert und per DC-, CE- und HPLC-MS-Analytik nachgewiesen. Aufgrund der Übertragung von dTDP-L-Rhamnose und UDP-/dTDP-aktivierten-D-Zuckern gehört SorF zu den in vitro sehr seltenen D- und L-Zucker-akzeptierenden Glykosyltransferasen. Darüber hinaus wurde SorF mit den Substraten dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose, dTDP-D-Glucose, UDP-D-Glucose und dTDP-L-Rhamnose kinetisch charakterisiert. Mit SorF und den zuvor für die Synthese von dTDP-aktivierten Desoxyzuckern verwendeten Enzymen konnte ein Enzym-Modul-System (EMS) entwickelt werden. Das EMS erlaubte erstmals die in vitro Herstellung eines glykosylierten Naturstoffes mit in situ Regeneration des Nukleotidzuckers. Durch Kombination von SuSy mit SorF konnte Glucosyl-Sorangiosid mit ca. 10 Zyklen (von max. 10) produziert werden. Außerdem konnten SuSy, RmlB, RmlC-His, RmlD-His und SorF zur in situ Synthese von Rhamnosyl-Sorangiosid kombiniert werden. Die dTDP-L-Rhamnose wurde über sechsmal recycliert, wobei auch noch etwas Glucosyl-Sorangiosid produziert wurde, da dTDP-D-Glucose ein besseres Substrat für SorF ist als die dTDP-L-Rhamnose. Auch die zusätzliche in situ Recyclierung des NADH mit der Formiat-Dehydrogenase für die 4-Ketoreduktase RmlD war im EMS möglich und verschlechterte die Ausbeute an Rhamnosyl-Sorangiosid kaum. Die Etablierung des EMS ermöglicht außerdem die schnelle Charakterisierung von Glykosyltransferasen (Substratpromiskuität) durch einfachen Austausch der Enzyme im Desoxyzucker-Modul oder der Aglyka. Darüber hinaus können hybrid glykosylierte Naturstoffe ohne aufwändige Synthese und Aufreinigung der dTDP-aktivierten Zucker mit einer solchen in situ Eintopfsynthese produziert werden. Um die Handhabung des EMS weiter zu vereinfachen, wurden die am EMS beteiligten Enzyme mit Ni-NTA-Magnet-Beads immobilisiert und auf Aktivität untersucht. Dabei zeigten die immobilisierten Enzyme RmlC-His/RmlD-His im Fotometer eine deutliche Aktivität. Aufgrund von Nachteilen der kommerziellen Magnet-Separatoren wurde ein neuer Magnet-Separatortyp (MAGICA-Separator) für die kontinuierliche Messung im Mikrotiterplattenfotometer entwickelt und zum Patent angemeldet. Er ermöglicht erstmals die kontinuierliche Messung von immobilisierten Enzymen im Mikrotiterplattenfotometer und erlaubt damit auch die kinetische Charakterisierung der Enzyme. Die Aktivität der Enzyme RmlC-His/RmlD-His, dTMP-Kinase und SuSy wurde mit dem MAGICA-Separator im immobilisierten Zustand gemessen und die dTMP-Kinase und SuSy auch kinetisch charakterisiert. Auch die Kombination mehrerer Enzyme (dTMP-Kinase und SuSy) im immobilisierten Zustand war möglich und es konnte eine Aktivität gemessen werden.

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