Expression, Reinigung und Charakterisierung von Makrolid-Glykosyltransferasen für die Synthese neuartiger Makrolid-Antibiotika

Schumacher, Thomas; Elling, Lothar (Thesis advisor); Hartmeier, Winfried (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2005)
Doktorarbeit

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2005

Kurzfassung

Die Makrolid-Glykosyltransferasen EryCIII, EryBV, OleG2 und TylMII wurde durch Fermentation von Saccharopolyspora erythraea im Labormaßstab produziert und die lösliche Expression aller Glykosyltransferasegene durch Immunoblotting und ELISA gegen den C-terminalen His6-tag der rekombinanten Enzyme nachgewiesen. Dabei wurden beispielsweise bei einer Fermentation von Saccharopolyspora erythraea pEXCIII auf Minimalmedium im 30-L-Maßstab 481 g Biofeuchtmasse gewonnen. Anhand der Desosaminyltransferase EryCIII wurde eine exemplarische Aufreinigungsstrategie für die Glykosyltransferasen entwickelt und EryCIII bis zur Homogenität aufgereinigt. Die Aufreinigungsstrategie setzte sich dabei aus Anionenaustauschchromatographie, IMAC und Gelfiltration zusammen. Ausgehend von 80 g Biofeuchtmasse wurden über eine präparative Aufreinigung durch Anionenaustausch und IMAC 72 mg EryCIII dargestellt. Bei der Bestimmung des nativen Molekulargewichts von EryCIII ließen sich sowohl Di- (98,3 kDa) als auch Trimere (130,7 kDa) nachweisen, aber überraschenderweise keine Monomere. Die Bestimmung der spezifischen Aktivität der Probe ergab einen Wert von 80 mU/mg. Während der biochemischen Charakterisierung zeigte sich, dass das pH-Optimum für die Reaktion von EryCIII im Bereich von pH 9 und das Temperaturoptimum bei 25°C liegt, und dass das Enzym seine enzymatische Aktivität über einen weiten pH- (pH 7 - 11) und Temperaturbereich (25°C - 45°C) entfalten kann. Die Untersuchung der thermischen Inaktivierung bei 30°C ergab für IMAC gereinigtes EryCIII eine Halbwertszeit von mehr als 2 Tagen. Somit ist EryCIII für den Einsatz in der kombinatorischen Biokatalyse gut geeignet. Weiterhin ist festzuhalten, dass EryCIII erstmalig in der in vitro Synthese von Makrolid-Antibiotika eingesetzt wurde. Neben Erythromycin D und Narbomycin wurden zwei neuartige Makrolid-Antibiotika, Desosaminyl-Rhamnosyl-Erythronolid B und Desosaminyl-Olivosyl-Erythronolid B, hergestellt. Die Produkte wurden über Massenspektrometrie identifiziert und wiesen eine antibiotische Aktivität gegen den Teststamm Kocuria rhizophila (ATCC 9341) auf. Untersuchungen zur Michaelis-Menten-Kinetik von EryCIII haben offenbart, dass Mycarosyl-Erythronolid B (MEB) und Rhamnosyl-Erythronolid B (REB), im Gegensatz zu Narbonolid und dTDP-D-Desosamin, zu einer deutlichen Substratüberschussinhibition führen (MEB: Ki = 4,0 ± 2,4 mM; REB: Ki = 2,7 ± 1,5 mM). Außerdem ergaben weitere Studien, dass sich die Enzymkinetik für Narbonolid signifikant von den anderen Enzymkinetiken unterscheidet. Dies zeigte sich besonders im sehr niedrigen Vmax-Wert von 3,8 ± 0,18 mU/mg (MEB: Vmax = 98,8 ± 37,7 mU/mg; REB: Vmax = 89,2 ± 35,5 mU/mg). Der Vergleich der Km-Werte zeigt weiterhin, dass EryCIII eine überraschend starke Affinität zu Narbonolid hat (Km = 0,3 ± 0,09 mM) und dass die Affinität für Mycarosyl-Erythronolid B (Km = 1,4 ± 0,96 mM) erwartungsgemäß größer ist als für Rhamnosyl-Erythronolid B (Km = 1,7 ± 1,1 mM). Für das Donorsubstrat dTDP-D-Desosamin wurde ein Vmax-Wert von 59,9 ± 1,6 mU/mg und ein Km-Wert von 1,3 ± 0,14 mM festgestellt. Vor dem Hintergrund eines Enzym-Modul-Systems für die Synthese von neuartigen Makrolid-Antibiotika durch kombinatorische Biokatalyse wurde ein System untersucht, das die in situ Regeneration von nukleotid-aktivierten Desoxyzuckern mit der Glykosylierung eines Akzeptormoleküls koppelt. Erste Versuche haben am Beispiel von EryCIII gezeigt, dass das Glykosyltransferase-Modul erfolgreich etabliert und mit dem SuSy- und dem Desoxyzucker-Modul verbunden werden konnte. Das bei der Glykosylierungsreaktion freiwerdende dTDP wurde mit Hilfe der Sucrose Synthase 1 aus Kartoffel und der dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose Dehydratase RmlB aus Salmonella typhimurium erfolgreich zur in situ Herstellung von dTDP-6-Desoxy-4-keto-D-glucose genutzt. Des Weiteren haben erste Versuche mit immobilisiertem EryCIII (Ni-NTA) gezeigt, dass das Enzym in immobilisierter Form verwendbar ist.

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