Selektive Markierung von Glykokonjugaten mit modifizierten Donorzuckern als Substrate von Glykosyltransferasen und Glykosidasen

Namdjou, Darius-Jean; Elling, Lothar (Thesis advisor); Hartmeier, Winfried (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2006)
Doktorarbeit

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006

Kurzfassung

Kernziel dieser Arbeit war die selektive Markierung krankeitsrelevanterGlykokonjugatstrukturen durch Glykosyltransferasen. Besonderes Augenmerk sollte auf die Untergalactosylierung der N-Glykane des IgG gelegt werden. Diese Struktur wird in der Literatur mit Rheumatoider Arthritis assoziiert. Für das selektive Labelling sollte der modifizierte Nukleotidzucker UDP-6-biotinyl-Gal als Donorsubstrat verwendet werden. Die in der AG Elling für das selektive Labelling vorhandenen Konstrukte der humanen beta4Gal-T1 sollten charakterisiert werden. Mit einem der Konstrukte sollte eine Mutagenisierung durchgeführt werden, um auch ein Labelling mit UDP-6-biotinyl-GalNAc zu ermöglichen. Darüberhinaus sollte gezeigt werden, ob die Technik des selektiven Transfers auch auf die Klasse der Glykosidasen auszuweiten ist.Die grundlegende Zielsetzung der hier vorliegenden Arbeit konnte erfüllt werden. So wurde zunächst die Synthese und vor allem die Isolierung des für den selektiven Transfer genutzten UDP-6-biotinyl-Gal optimiert. Ebenfalls erfolgreich war die Mutagenisierung der humanen beta4Gal-T1. Durch eine gezielte Punktmutation konnte ein Enzym erhalten werden, welches eine UDP-GalNAc-Transferaktivität aufweist. Zusammen mit drei Konstrukten der humanen beta4Gal-T1, der freien, luminalen und His6-TagPropeptid-beta4Gal-T1 wurde auch die Mutante His6-TagPropeptid-beta4Gal-T1(Y284L) charakterisiert. Es wurde das Substratspektrum, das pH-Optimum sowie die Restaktivität mit verschiedenen Metallionen untersucht. Darüberhinaus wurden alle Konstrukte kinetisch charakterisiert. Dabei konnten überraschenderweise Konstrukte gefunden werden, die, je nach Spezifität UDP-6-biotinyl-Gal auf den Monosaccharid-Akzeptor GlcNAc beta1-Bn oder auf das Glykoprotein Ratten IgG übertragen. Ein Transfer von UDP-6-biotinyl-GalNAc mit der His6-TagPropeptid-beta4Gal-T1(Y284L) blieb aus. Dennoch könnte das Enzym im Hinblick auf eine chemoselektive Kopplung, bei der zunächst ein eine geringe Modifikation tragendes UDP-GalNAc auf ein Glykokonjugat übertragen würde, noch wertvoll sein. Mit den Konstrukten freie und luminale beta4Gal-T1 konnte ein Transfer-Assay auf untergalactosylierte Strukturen erfolgreich durchgeführt werden. Mit dem Modellprotein IgG der Ratte wurden die Transfer- und Nachweisbedingungen optimiert. So konnte ein Sandwich-ELSA als Nachweis-Methode etabliert werden. Im Weiteren konnte die unterschiedliche Untergalactosylierung der N-Glykane der IgG verschiedener Spezies erfolgreich nachgewiesen werden. Durch Nachweis des Erfolgs des selektiven Transfers und der Möglichkeit, verschieden hohe Untergalactosylierungen zu unterscheiden, war das hochrangigste Ziel dieser Arbeit realisiert. Zudem wurde eine Strategie zur Quantifizierung des Grades der Biotinylierung verschiedener IgGs etabliert. Es zeigte sich, dass die freien GlcNAc-Reste der N-Glykane des Human IgG annähernd quantitativ biotinyliert werden können. Die einfache Nachweistechnik im Mikrotiterplattenformat durch den Sandwich-ELSA sowie der hohe Biotinylierungsgrad wecken große Hoffnungen in Richtung einer Frühdiagnostik der Rheumatoiden Arthritis. Mit pNP-6-biotinyl-Gal(NAc) wurden potentielle Substrate des selektiven Transfers durch Glykosidasen im 100 mg-Maßstab synthetisiert und isoliert. Eine erfolgreiche Hydrolyse oder ein Transfer dieser Derivate blieb allerdings aus. Jedoch konnten auch die Oxidationsprodukte, pNP-6-oxo-Gal(NAc), isoliert werden. Für beide Zucker konnte nachgewiesen werden, dass sie Substrate von Glykosidasen sind. Transglycosylierung von pNP-6-oxo-GalNAc mit GlcNAc und nachfolgende chemische Oxidation an der Aldehyd-Funktion erbrachte einen der besten bisher bekannten Hochaffinitäts-Liganden für natürliche Killerzell-Rezeptoren.

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