PEG-gebundene Oligosaccharide als biomolekulare Erkennungsstrukturen auf Grenzflächen

  • PEG-bound oligosaccharides as biomolecular recognition structures on surfaces

Sauerzapfe, Birgit; Elling, Lothar (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2008)
Doktorarbeit

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Kurzfassung

Das vorliegende Dissertationsvorhaben „PEG-gebundene Oligosaccharide als biomolekulare Erkennungsstrukturen auf Grenzflächen“ hatte das Ziel, erstmals Glykane und deren spezifische Wechselwirkungen mit weiteren Proteinen der extrazellulären Matrix für die Biofunktionalisierung von Oberflächen zu nutzen. In der Natur umgeben Zuckerstrukturen die Oberflächen der tierischen Zellen und agieren somit als Antennen und Informationsträger. Ein bedeutendes Glykokonjugat ist Poly-N-Acetyllaktosamin (Poly-LacNAc), ein Polysaccharid bestehend aus repetierenden Galaktose- und N-Acetylglukosamin (GlcNAc)-Untereinheiten. Diese Zuckerketten sind für die inter- und intrazelluläre Kommunikation verantwortlich. Des Weiteren wird Poly-LacNAc durch Galektine gebunden und ist damit in die galektin-abhängige Bindung von extrazellulären Glykoproteinen, wie z. B. Laminin und Fibronektin, involviert. Daher sollten Poly-LacNAc-Strukturen chemo-enzymatisch synthetisiert, auf Oberflächen immobilisiert und für die Bindung von extrazellulären Matrixproteinen für eine gerichtete Zelladhäsion charakterisiert werden. Das Ziel konnte erfolgreich realisiert werden. Innerhalb dieser Arbeit war es möglich eine artifizielle extrazelluläre Matrix ausgehend von immobilisierten Poly-LacNAc-Strukturen auf PEG-Sternhydrogelen effizient aufzubauen. Zunächst mussten dafür chemisch modifizierte Zucker produziert werden, die sowohl eine selektive Immobilisierung als auch eine effektive enzymatische Poly-LacNAc-Synthese ermöglichten. Das beta-D-GlcNAc-Linker-NH2-tBoc stellte sich dabei als ideales Substrat für die biokatalytischen Umsätze heraus. Das Akzeptorglykosid war aufgrund seines Linkers durch die HPLC quantifizierbar und durch C18-Säulen effizient aufzureinigen. Die rekombinante His6-Propeptid-cat-beta-4GalT-1 konnte das hydrophobe GlcNAc optimal umsetzen und zeigte damit den positiven Einfluss eines Fusionsproteins auf die biokatalytischen Eigenschaften der humanen beta-4GalT-1. Die effiziente Poly-LacNAc-Synthese konnte in Kombination mit der beta-3GlcNAcT von Helicobacter pylori durchgeführt werden. Dabei wurden nicht nur spezifische Oligosaccharide, sondern auch eine heterogene, aber definierte Mischung von Poly-LacNAc-Strukturen produziert. Die enzymatischen Syntheseprozesse wurden detailliert kinetisch untersucht. In einem weiteren Schritt konnte die erfolgreiche Produktion von modifizierten Poly-LacNAc-Strukturen, wie Galili-Epitope, Sialyl- und sulfatierte LacNAc-Strukturen, etabliert werden. Für die Analyse und Bindung der produzierten Poly-LacNAc-Strukturen wurde neben den kommerziellen pflanzlichen Lektinen auch das fungale Galektin CGL2 als Modellgalektin verwendet. Dieses wurde für eine effiziente Aufreinigung und für eine spezifische Detektion mit einem N-terminalen His6-Tag versehen und rekombinant in E. coli produziert. Innerhalb der neu etablierten Mikrotiterplatten-Testsysteme konnte nicht nur die optimale Zuckerbindungsstruktur des Galektins His6CGL2 bestimmt werden, sondern auch die weitere Bindung der ECM-Proteine Laminin und Fibronektin an eine optimierte Schicht nachgewiesen werden. Dabei stellte sich die definierte heterogene Poly-LacNAc-Mischung mit einer Zusammensetzung aus überwiegend Di- bis Tetra-LacNAc-Strukturen als optimaler Ligand heraus, der bisher für Untersuchungen in der glykobiologischen Forschung vernachlässigt wurde. Diese Ergebnisse konnten auf die Funktionalisierung von PEG-Sternhydrogelen übertragen werden. Das Mikrokontaktstempeln mit komplexen Zuckerstrukturen konnte etabliert und optimiert werden. Ausgehend von immobilisierten Poly-LacNAc-Strukturen wurde eine artifizielle Matrix mit Kollagen IV aufgebaut. Dabei konnte dieser Aufbau sowohl mit quervernetzendem multivalenten Galektin His6CGL2 als auch ohne etabliert werden. Die ersten Zellversuche mit der Mausfibroblasten Zelllinie L929 und humanen Fibroblasten zeigten das enorme Anwendungspotential dieser Oberflächen für die Biomaterialforschung. Die Zellen konnten sehr gut auf den biomimetischen Schichten adhärieren und proliferieren. Zusammenfassend bleibt zu betonen, dass in dieser Arbeit zum ersten Mal die native Bindung von komplexen glykosylierten extrazellulären Matrixproteinen über die Multivalenz der Galektine an eine mikrostrukturierte Poly-LacNAc-PEG-Sternschicht gezeigt werden konnte. Dabei ist vor allem die etablierte effiziente chemische Synthese des modifizierten Akzeptorsubstrats GlcNAc als auch die einfach durchzuführende und effektive Synthese einer heterogenen, aber definierten Poly-LacNAc-Mischung durch den kombinierten Einsatz der beta-4GalT und beta-3GlcNAcT hervorzuheben. Diese Mischung scheint am ehesten die natürliche Situation zu imitieren und die Galektinbindung hoch-affin zu vermitteln. Zukünftige Arbeiten mit komplex verzweigten Zuckerstrukturen, mit humanen Galektinen und mit weiteren Zelltypen können weitere neuartige Impulse für die Biomaterialforschung hervorbringen.

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