Modulare Enzym-Kaskaden zur Synthese von Glykanepitopen

  • Modular Enzyme Cascades for the Synthesis of Glycan-Epitopes

Engels, Leonie; Elling, Lothar (Thesis advisor); Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2015)
Doktorarbeit

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2015

Kurzfassung

Ziel der vorliegenden Arbeit war die in vitro Synthese des nicht-sulfatierten HNK-1 Epitops (GlcA(β1-3)Gal(β1-4)GlcNAc(β1-R) und des Glykanepitops 2´ Fukosyllaktose (2´ FL, Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Glc) sowie die Bereitstellung von UDP-Glukuronsäure (UDP GlcA) als Donorsubstrat für das nicht-sulfatierte HNK-1 Epitop mithilfe von modularen Enzym-Kaskaden.Für die Synthese von UDP-GlcA erwiesen sich zwei UDP-Glukose-Dehydrogenasen, die humane His6UGDH und die bakterielle His6KfiD aus E. coli K5, als geeignete Enzyme. Aufgrund der höheren katalytischen Effizienz wurde die rekombinante His6UGDH jedoch favorisiert. Für die Synthese von UDP-GlcA wurden drei verschiedene Lösungsansätze überprüft. Dem direkten einstufigen Weg mit dem UGDH-Modul wurden zwei kombinatorische Synthesestrategien gegenübergestellt. In einem Ein-Topf System erfolgte die Kopplung des SuSy-Moduls mit dem UGDH-Modul und die Kopplung des SuSy- und UGDH-Moduls mit dem UMPK-Modul. Für das UMPK-Modul wurde die humane UMP-Kinase erfolgreich kloniert und charakterisiert. In allen Synthesestrategien konnte die Funktionalität der ausgewählten Enzym-Modul-Systeme (EMS) durch die Bestätigung der molekularen Masse von UDP-GlcA mittels ESI-MS Analyse nachgewiesen werden. Der direkte Syntheseweg für UDP-GlcA wird wegen seiner kürzeren Synthesezeit und der chemischen Instabilität des Nukleotidzuckers bevorzugt. Mit der Regeneration des Kofaktors NAD+ stellt dieser Weg ausgehend von UDP-Glukose (UDP-Glc) und den rekombinanten Enzymen His6UGDH und His6NOX eine kosten- und zeiteffiziente Methode dar, mit der 92% Ausbeute erreicht werden. Für die Synthese des nicht-sulfatierten HNK-1 Epitops mit dem GlcAT Modul musste zunächst eine Glukuronyltransferase, die GlcA von UDP-GlcA regiospezifisch auf die Akzeptorstruktur LacNAc Linker-t-Boc überträgt, in E. coli produziert und biochemisch charakterisiert werden. Die murine His6catGlcAT-P erwies sich dabei für das geplante EMS zur Synthese von Glukuroniden als sehr gut geeignet. Bei der stufenweisen Optimierung der Enzym-Kaskaden gelang erstmals die Kopplung des SuSy-Moduls mit dem UGDH- und GlcAT Modul in einem Ein-Topf System. Dabei wurde im präparativen Maßstab für das nicht-sulfatierte HNK-1 Epitop eine Ausbeute von 79% erzielt. Mithilfe der integrierten in situ Regeneration von UDP-GlcA wurde der teure Nukleotidzucker in ca. 18 Umläufen rezykliert. Somit führt der Einsatz von katalytischen Mengen UDP zu reduzierten Synthesekosten. Das entwickelte EMS stellt einen innovativen Ansatz zur in vitro Synthese des nicht-sulfatierten HNK-1 Eptitops dar und bietet mit seiner hohen Flexibilität darüber hinaus die Möglichkeit, weitere Glukuronyltransferasen zu testen und neue Glukuronide zu synthetisieren. Zur Produktion des Glykanepitops 2´-FL konnte WbgL aus E. coli O126 als neuartige α1,2 Fukosyltransferase identifiziert werden. Diese zeigt im Vergleich zu FutC trotz der niedrigen Sequenzhomologie eine dreifach höhere Aktivität für das nicht-natürliche Akzeptorsubstrat Laktose. Damit ist WbgL für die enzymatische Produktion von 2´ FL und weiteren natürlichen sowie modifizierten α1,2-fukosylierten Galakto-Oligosacchariden geeignet. Darüber hinaus ermöglichte die Produktion der bifunktionalen L Fukokinase/L-Fuc-1-P Guanylyltransferase (FKP) aus Bacterioides fragilis 9343 die präparative Synthese des Donorsubstrates GDP-Fukose (GDP-Fuc) mit einer Ausbeute von 100% im FKP-Modul. Durch Kopplung des FKP-Moduls mit dem FucT-Modul konnte die abschließende präparative Synthese von 2´ FL im klassischen sequentiellen Modus etabliert werden. Die neuartige α1,2 Fukosyltransferase WbgL wurde unter dem Aktenzeichen PCT. Int. Appl. (2012), WO 2012097950 A1 20120726, zum internationalen Patent angemeldet. Zurzeit wird sie von der Fa. Jennewein Biotechnologie GmbH (Bonn, Germany) im industriellen Maßstab genutzt.

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