Biofunktionalisierung von Biomaterialoberflächen mit poly-LacNAc und den Galektinen-1, -3 und -8

  • Biofunctionalization of biomaterial surfaces with poly-LacNAc and the galectins-1, -3 and -8

Rech, Claudia; Elling, Lothar (Thesis advisor); Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Aachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University (2015)
Doktorarbeit

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2014

Kurzfassung

Ziel der Arbeit war es, eine modulare, künstliche extrazelluläre Matrix (ECM) mit poly-LacNAc, den humanen Galektinen-1, -3 und -8 und ECM-Glykoproteinen auf einer möglichen Biomaterialoberfläche aufzubauen. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Synthese von poly-LacNAc charakterisiert, optimiert und im mg Maßstab vergrößert. Dies beinhaltete die Optimierung der einzelnen Schritte von der Enzymexpression und aufreinigung über die Synthese bis zur Produktisolierung. Die Untersuchung der Eintopfsynthese der poly-LacNAc-Mischung bildete dabei den Hauptteil. Optimiert wurde das Verhältnis der Substrate und der Enzyme sowie deren Menge. Bei der Charakterisierung der Eintopfsynthese mit unterschiedlichen Enzymverhältnissen zeigten sich unerwartete Produktverteilungen, die durch eine Kinetik mit längerkettigen Substraten erklärt werden konnten: Die beta3GlcNAcT weist eine deutlich höhere Aktivität zum Tetrasaccharid auf. Die Synthese ausgehend von verschieden langen Akzeptorsubstraten zeigte eine Limitierung der Kettenlänge ab dem Nonasaccharid. In der semi-präparativen Synthese konnten poly-LacNAc-Strukturen erstmalig bis zu Hexadecasaccharid detektiert und bis zu Dodecasaccharid isoliert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die humanen Galektine-1, -3 und -8 im Hinblick auf ihren Einsatz zum Aufbau einer modularen, biomimetischen ECM untersucht. Außerdem wurden allgemeine proteinchemische Fragen wie Stabilität und Einfluss des His6-Tags diskutiert. Mit allen drei Galektinen (His6Gal-1C2S, His6Gal-3 und His6Gal-8) war es möglich, die ECM-Glykoproteine Laminin und Fibronektin an immobilisierten poly-LacNAc-Strukturen quer zu vernetzen. Dabei erfolgte die Bindung von His6Gal-1C2S bereits an das Disaccharid LacNAc auf Hydrogelen. Im Gegensatz dazu benötigen die Galektine-3 und -8 sowie das Modellgalektin CGL2 für eine optimale Bindung an poly-LacNAc auf Hydrogelen längerkettige Strukturen. Folglich ist die poly-LacNAc-Mischung für den ersten Aufbau ohne weitere spezifische Epitope die optimale Variante. Im dritten Teil wurde eine neuartige Screeningplattform mit Hydrogel in der Mikrotiterplatte entwickelt. Die Galektine konnten dadurch auf der letztendlichen Biomaterialoberfläche charakterisiert werden. Schlussendlich wurde die biomimetische Oberfläche als proof-of-principle mit Fibroblasten getestet. Auf den humanen Galektinen (gebunden an poly-LacNAc) zeigten sie dabei sehr gute Adhäsion und Wachstum. Dies ist auch auf der Oberfläche poly-LacNAc-Galektin-Fibronektin der Fall. Die genaueren Untersuchungen mit dem Modellgalektin CGL2 ließen vermuten, dass die biomimetische ECM im Vergleich zur Standardoberfläche und zu immobilisiertem Fibronektin deshalb adhäsiver und wachstumsfördernder wirkt, weil sie zum einen eine ECM bereits präsentiert und diese von den Zellen nicht aufgebaut werden muss. Zum anderen ist sie flexibler als immobilisiertes Fibronektin und kann von den adhärenten Zellen umgestaltet werden.

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